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PCR實驗室,你了解嗎?
2022-03-29 瀏覽次數(shù):237
PCR實驗,即臨床基因擴增實驗,是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進行擴增的方法,測出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。就新冠病毒核酸檢測來,RT-PCR是目前使用最廣泛和較準確的篩選和確認方法。
一、PCR實驗室的核心難題
實驗室的平面布局、空調(diào)通風系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制等都是圍繞同一個核心問題進行——“避免污染”,任何級別的醫(yī)院在建設(shè)PCR實驗室時,均需要提前考量各個因素,以保證標本的全環(huán)節(jié)質(zhì)量及實驗室的生物安全。
1.建設(shè)要求。PCR實驗室的建設(shè)需要設(shè)置標準的“四區(qū)”:試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、PCR擴增檢測區(qū)和擴增產(chǎn)物檢測區(qū)。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū),各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié),使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染,并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
2.人員要求。進入PCR實驗室,需要經(jīng)過從基礎(chǔ)理論、實驗原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項等規(guī)范的培訓,并獲取PCR上崗證。
3.檢測風險。檢測過程中,樣本的開蓋,核酸提取的震蕩、離心都有可能生氣溶膠,有感染的風險。
4.防護要求。必須按照生物安全三級實驗室的個人防護要求進入。
二、PCR實驗的污染來源都有哪些?
1.樣本間交叉感染:收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴導致外溢;不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖;移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌;不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散,相互交叉污染。
2.實驗試劑污染:主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中,由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。加樣過程中,因為PCR試劑對溫度十分敏感,需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃,但這個過程也充滿污染風險。
3.擴增產(chǎn)物污染:大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋,這是PCR反應中最主要、最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大,遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可形成假陽性。
4.克隆質(zhì)粒污染:作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。
三、防止實驗污染有哪些措施?
1.正確佩戴手套:手套未緊密貼合拇指、食指和中指,在進行開蓋操作時容易發(fā)生交叉污染。
2.正確使用生物安全柜:簡單、整潔、避免通風口堵塞;操作前后紫外線照射,消毒劑隨手可及;廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液,并且及時清理廢液缸,保證廢物不超過廢液缸體積的2/3。
3.核酸提取儀去污染:每天多批次檢測時,在每一批次檢測完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對儀器進行去污染。
4.重視通風:不定期對房間進行通風,每次至少持續(xù)30min。
5.PCR擴增區(qū)去污染:PCR反應管必須蓋緊,避免擴增后的核酸對環(huán)境的污染。
6.實驗室隨手可及的消毒劑。
四、PCR實驗室的空氣流向與環(huán)境消毒
PCR實驗室可分為試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)和產(chǎn)物檢測區(qū)四個區(qū)域,這四個區(qū)域在物理空間上必須完全相互獨立,各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中,應當始終處于完全的分隔狀態(tài),不能有空氣的直接相通。所以,臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向應按:試劑準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物檢測區(qū),應時刻防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前區(qū)域??砂凑丈鲜鲰樞騾^(qū)域空氣壓力遞減的方式進行,也可通過安裝排風扇、負壓排風裝置或其他可行方式實現(xiàn)。
臨床基因擴增檢驗實驗室的環(huán)境清潔:《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》中有對物表清潔、消毒的要求,不同的實驗區(qū)域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。
1.基本原則:由清潔區(qū)向污染區(qū)進行,潔具不可交叉。
2.清潔消毒方向:準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物檢測區(qū)。
3.清潔消毒范圍:工作區(qū)域的物體表面(含桌、椅),可使用含氯消毒劑擦拭消毒,空氣和工作臺面可使用紫外線照射消毒,也可使用空間消毒器進行全環(huán)節(jié)消毒。
4.不可使用紫外線消毒器及化學消毒進行有人狀態(tài)下的消毒。
5.PCR室內(nèi)的消毒應防止揚塵(減少人員走動)、殺滅DNA或RNA的基因片段??蛇x擇懸掛紫外線燈管進行空氣消毒,試驗前照射30-60分鐘,實驗結(jié)束照射30-60分鐘,必要時延長照射時間(可照射一夜)。
6.終末消毒:當出現(xiàn)實驗室污染時,應按要求立即撤出相關(guān)人員,在無人情況下可使用化學消毒劑進行終末消毒,如熏蒸法:過氧乙酸1g/ m³加熱熏蒸(濕度70-90%),密閉24小時;氣溶膠噴霧:3%過氧化氫:20mL/m³氣溶膠噴霧;5%過氧乙酸2.5mL/m³氣溶膠噴霧(濕度20-40%)。
五、日常清潔消毒應該如何做?
1.每日工作前后,對工作區(qū)域表面、地面進行清潔并消毒,使用含氯消毒液擦拭。清潔采用濕式、不揚塵的方式進行。
2.物品防塵存放。墻面定期清潔,有可見污染及時進行清潔消毒。
3.配備移動紫外線消毒裝置進行空氣和物表的消毒。
4.生物安全柜的消毒:
a.每天工作前:對生物安全柜的內(nèi)表面進行消毒,包括工作臺面和內(nèi)壁使用消毒劑擦拭。
b.工作結(jié)束:柜內(nèi)物品全部消毒后移出。消毒劑擦拭臺面四周、以及玻璃內(nèi)側(cè)燈部位。
c.消毒劑應選擇能夠殺死生物安全柜里可能發(fā)生的任何微生物(70%乙醇、含氯消毒劑)。在使用漂白劑等腐蝕性消毒劑后,還應用無菌水再次進行擦拭。
d.停用生物安全柜前,運行5min以凈化內(nèi)部空氣。
e.終末消毒:需要進行終末消毒的時機:生物安全。
六、試驗完成后,物品及環(huán)境如何處理?
1.做好廢液及固廢處理。
2.實驗室空間消毒:在室溫,50-60%濕度條件下,使用過氧乙酸熏蒸2g/m³,過夜;或使用20g/l氣溶膠噴霧,用量8g/m³。
3.物體表面消毒液:0.55%含氯消毒劑,現(xiàn)用現(xiàn)配,24小時內(nèi)使用。