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PCR 實驗室通風空調(diào)設(shè)計參考

2022-12-07 瀏覽次數(shù):194   

一、PCR實驗室概述
PCR 即聚合酶鏈式反應(yīng),又稱無細胞分子克隆系統(tǒng)或體外酶促基因擴增法。其基本原理類似于 DNA 的天然復(fù)制過程,是在模板 DNA、引物和 4種脫氧核苷酸存在的條件下,依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng),將待擴增的DNA片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán),使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加,該技術(shù)可以將極微量的靶DNA 特異地擴增上百萬倍,從而在短時間內(nèi)獲得所需的大量特定基因片段,因此能在臨床上檢測單分子 DNA或每 10 萬個細胞中僅含 1 個靶 DNA 分子的樣品。
二、PCR 實驗室平面布局
根據(jù)《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準》規(guī)定,臨床基因擴增檢驗實驗室需要設(shè)置試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)等四個區(qū)域。如使用全自動分析儀,區(qū)域設(shè)置可以適當合并。雖然 PCR 實驗室的四個功能分區(qū)是固定的,但各醫(yī)院在實際布置中卻千差萬別,其主要布置形式有分散式和集中式兩種。
分散式:各實驗用房彼此相距較遠,呈分散布置形式。各實驗之間不易相互干擾。
集中式:完成 PCR 四個實驗過程的實驗用房相鄰布置,形成集中、獨立的實驗區(qū)域。每個實驗室應(yīng)設(shè)置獨立緩沖間、實驗室間應(yīng)設(shè)置帶消毒裝置的傳遞窗。
在理想情況下,PCR 實驗室緩沖間內(nèi),可設(shè)置正壓,使室內(nèi)空氣不流向室外,室外空氣不流向室內(nèi)。若房間進深允許,可設(shè) PCR 內(nèi)部專用走廊。在減少室內(nèi)外空氣交換方面,緩沖間比專用走廊更有意義。試劑和標本通過機械連鎖傳遞窗傳遞,保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染,達到人、物分流。
三、PCR 實驗室的主要功能和設(shè)備配置
1. 試劑儲存和準備區(qū)
該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū),不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi),并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
2. 標本制備區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸 (RNA、DNA) 提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA 的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓,以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外,由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染,所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。對具有潛在傳染危險性的材料,必須在生物安全柜內(nèi)開蓋,并有明確的樣本處理和滅活程序。
3. 擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA 擴增。此外,已制備的 DNA 模板和合成的 cDNA( 來自樣本制備區(qū) ) 的加入和主反應(yīng)混合液 ( 來自試劑貯存和制備區(qū) ) 制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式 PCR 測定中,通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管,因此巢式擴增有較高的污染危險性,第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。
四、PCR 實驗室空調(diào)通風設(shè)計
1. 設(shè)計依據(jù)
國際上,世界衛(wèi)生組織(WHO)一直非常重視實驗室生物安全問題,早在 1983 年就出版了《實驗室生物安全手冊》,2003年4月第二版 ( 修訂版 ) 以電子版形式在 WHO 網(wǎng)頁上問世。美國在實驗室的生物安全管理方面更是走在了世界的前列,NIH/CDC 聯(lián)合出版的《微生物學及生物醫(yī)學實驗室生物安全準則》現(xiàn)已推出了第四版。很多國家在制定本國的生物安全準則時,主要參考上述兩個標準。我國關(guān)于 PCR 實驗室建設(shè)及管理的現(xiàn)行技術(shù)規(guī)范和標準有以下幾種:
《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》
《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)【2010】194 號
《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》
《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》 GB50346-2011
《實驗室生物安全通用要求》GB19489-2008
《潔凈廠房設(shè)計規(guī)范》GB50073—2013
《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》WS233-2002 中華人民共和國衛(wèi)生部
  實驗室規(guī)范《JGJ91 科學實驗室建筑設(shè)計規(guī)范》等
2. 設(shè)計參數(shù)
根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》:對于涉及臨床樣本的操作,應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護設(shè)備、個人防護和操作規(guī)范的要求。典型的二級生物安全水平實驗室(圖片由CUH2A,Princeton, NJ, USA 提供)。根據(jù)《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》GB50346-2011 中,生物安全實驗室分級。根據(jù)實驗室所處理對象的生物危害程度和采取的防護措施,生物安全實驗室分為四級。微生物生物安全實驗室二級可采用BSL-2 表示。

 
根據(jù)《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》GB50346-2011生物安全實驗室二級屏障的主要技術(shù)指標:
  
根據(jù)《臨床基因擴增(PCR)檢驗實驗室規(guī)范》中對于房間正負壓的要求:標本制備區(qū):可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。擴增區(qū):可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。擴增產(chǎn)物分析區(qū):采用負壓條件或減壓情況下 ( 如安裝排風扇 ) 可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性。
另外,根據(jù)《JGJ91 科學實驗室建筑設(shè)計規(guī)范》:
噪聲要求:通用實驗室、學術(shù)活動室允許噪聲級不宜大于55dB(A 聲級 );研究工作室、閱覽室允許噪聲級不應(yīng)大于 50dB(A 聲級 )。采暖空調(diào)溫、濕度要求:采暖地區(qū)通用實驗室的冬季采暖室內(nèi)計算溫度應(yīng)為 18~20℃。通用實驗室的夏季空氣調(diào)節(jié)室內(nèi)計算參數(shù)為:溫度26~28℃,相對濕度小于 65%。
總結(jié)各規(guī)范標準與實際使用需求,以下是空調(diào)通風室內(nèi)設(shè)計參數(shù)總結(jié)表:通過工藝平面設(shè)計,使 PCR 實驗室具有合理的功能布局,以符合生物安全規(guī)范中潔污分流和防止交叉感染等方面的要求;同時通過對送入室內(nèi)的新風量和排出室外的排風量進行控制,使室內(nèi)按照設(shè)計要求建立相應(yīng)的壓力梯度,防止污染物的進入或擴散;采取過濾或殺菌消毒措施有效去除空氣中會影響實驗結(jié)果的微生物和塵埃等;采取合理的氣流組織,保證室內(nèi)氣流均勻、減少死角,并保證全面通風時的氣流組織與生物安全柜等局部排風裝置運行時的氣流組織相協(xié)調(diào)。
3. 空調(diào)設(shè)計
空調(diào)負荷主要有以下幾部分構(gòu)成:圍護結(jié)構(gòu)負荷、人員負荷(一般少于常規(guī)房間)、照明負荷、設(shè)備負荷(包含生物安全柜、冰箱、離心機、滅菌鍋、凍干機等設(shè)備)、新風負荷(最大組成部分)。
采取的空調(diào)形式可以有兩種:
1)全空氣系統(tǒng)
設(shè)置全空氣空調(diào)系統(tǒng)時,采取以下措施:
初效 +中效 +高效的三級過濾;
空調(diào)風機變頻,選用運行曲線陡降型;
對于設(shè)置生物安全柜的房間設(shè)置變風量新風系統(tǒng);全面排風與生物安全柜排風分開設(shè)置。
2)凈化風機盤管 + 變風量新風系統(tǒng)
設(shè)置凈化風機盤管 + 變風量新風系統(tǒng)時,采取以下措施:
凈化風機盤管送、回風口采用低阻高中效過濾器,超低阻高中效過濾器對大氣菌的過濾效率達到 95%;
新風系統(tǒng)根據(jù)房間內(nèi)生物安全柜的運行情況變頻運行;
全面排風與生物安全柜排風分開設(shè)置。
4. 通風過濾與氣流組織設(shè)計
1)通風系統(tǒng):全面通風:換氣次數(shù)≥6次/ 小時;送風采用新風機組經(jīng)熱、濕處理及三級(初效+中效+亞高效)過濾后送入室內(nèi);排風口設(shè)置于房間的下部,且在排風口設(shè)置高效過濾器;新風機組和排風機均采用變頻機組,以應(yīng)對工況的改變。
局部排風:生物安全柜,柜口面風速≥ 0.5m/s;采用Ⅱ級 B2 型生物安全柜;生物安全柜排風系統(tǒng)單獨設(shè)置,高空排放,且在排風入口設(shè)置高效過濾器,室外排風口高于所在建筑物屋面2m 以上;多臺生物安全柜并聯(lián)運行時應(yīng)采用變風量排風系統(tǒng),其新風補風系統(tǒng)也應(yīng)變風量運行。
2)過濾:英國倫敦公共衛(wèi)生中心實驗室 Nobel 的測定結(jié)果顯示,空氣中某些病毒和細菌的單體氣溶膠等效中值直徑為7.7~17.2μm 之間。因此,PCR 實驗室末端過濾器采用亞高效過濾器(粒徑≥ 0. 5μm,99.9>η>95,額定風量下的初阻力≤ 120Pa,效率為大氣塵計數(shù)效率)滿足使用要求。
3)氣流組織:為避免交叉污染,PCR 實驗室空氣流向必須嚴格遵循單一方向進行,即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)進行。
此外,還需遵循以下原則:氣流組織采用上送下排,送風口和排風口布置應(yīng)使室內(nèi)氣流停滯的空間降低到最小程度。在生物安全柜操作面或其他有氣溶膠操作地點的上方附近不得設(shè)送風口。單向布置,不應(yīng)有障礙。高效過濾器排風口應(yīng)設(shè)在室內(nèi)被污染風險最高的區(qū)域。
5. 壓差控制
PCR 實驗室壓差控制方案:
風量和排風量:縫隙法計算實驗室及緩沖間保持一定壓力時所需要的送風計算公式:


其中 △P—壓差(Pa)
Ρ —空氣密度,取 1.2kg/m³
V—流量,m3/h
A—根據(jù)縫隙寬度計算的泄漏面積㎡
μ—常數(shù),取0.72
由以上公式可知,在實驗室內(nèi)排風量確定的情況下,通過調(diào)節(jié)進入實驗室的送風量可以維持房間和參照區(qū)域恒定的壓差。此計算風量可以作為設(shè)計的依據(jù),由此來對新風機組、排風機組及附屬的風管、風口等進行選型和計算。但是在實際操作中,施工安裝的門、窗的結(jié)構(gòu)形式及氣密性等參數(shù)可能會與設(shè)計院選用的設(shè)計值有偏差;實驗室長期運行后維護結(jié)構(gòu)的氣密性和縫隙的寬度也會發(fā)生一定的變化,這些因素都會對原縫隙法計算的結(jié)果造成影響,進而使室內(nèi)的壓力梯度變化,嚴重時影響實驗室的實驗結(jié)果,特別是人員進出房間開、關(guān)門時的漏風,會迅速破壞室內(nèi)的壓力梯度。
由于以上問題的存在,再進行 PCR 實驗室個房間壓差控制時,除了通過縫隙法計算基礎(chǔ)風量外,還通過安裝壓差控制器,測量實驗室、緩沖間與參照區(qū)域間的實際壓差,和設(shè)定值進行比較,根據(jù)控制器的PID運算得出偏差值,以此為信號控制送風閥的動作,進而對房間送風量及送 / 排風量差進行調(diào)節(jié),從而最終控制房間的壓差值。這種控制需要系統(tǒng)中的變風量調(diào)節(jié)閥實現(xiàn)閉環(huán)控制,同時需要送、排風閥的執(zhí)行機構(gòu)有快速的反應(yīng)能力。根據(jù)實驗證明,控制生物安全柜排風的變風量調(diào)節(jié)閥響應(yīng)時間小于1S且實驗室內(nèi)通風系統(tǒng)的風量平衡相應(yīng)時間小于3S時,生物安全柜調(diào)節(jié)窗位置改變不會引起柜內(nèi)氣體外溢的現(xiàn)象發(fā)生。


為了防止實驗室開 / 關(guān)門窗引起室內(nèi)與緩沖間、緩沖間與專用走道間出現(xiàn)壓差為0時送風系統(tǒng)變風量風閥開度很小甚至關(guān)閉的情況發(fā)生,PCR 實驗室送風變風量閥應(yīng)預(yù)設(shè)風量偏移限制,以避免特殊情況發(fā)生導致大面值泄漏時出現(xiàn)送風量過小的現(xiàn)象發(fā)生。
五、參考文獻
1.《民用建筑供暖通風與空氣調(diào)節(jié)設(shè)計規(guī)范》GB50736-2012
2.《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》 GB50346-2011
3.《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》
4.《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)【2010】194 號
5.《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》
6.《實驗室生物安全通用要求》GB19489-2008
7.《潔凈廠房設(shè)計規(guī)范》GB50073—2013
8.《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》WS233-2002 中華人民共和國衛(wèi)生部
9.《JGJ91 科學實驗室建筑設(shè)計規(guī)范》
10.《高效空氣過濾器》GB13554-2008
11.《實驗室生物安全手冊》第四版

 

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